拿到一条编码序列后，有时需要了解同一种氨基酸在这条序列里常用哪些密码子。DNAMAN可以按指定阅读框生成密码子使用表，列出每种密码子的出现次数、每千密码子频率和同义密码子中的占比。这几个数字看起来相近，回答的问题却各不相同。统计前还要确定编码区的边界和方向，因为即使使用同一段DNA，起读位置偏移一个碱基，三联体的划分也会跟着改变。

　　一、DNAMAN怎么统计密码子使用频率

　　DNAMAN按当前序列的分析区域和所选阅读框统计密码子。手头已有按编码方向提取的编码序列，也就是CDS时，可以直接从这条序列入手。以下使用DNAMAN英文界面的菜单名称。

　　1、把编码序列载入当前通道

　　如果源文件包含整段基因组、质粒序列或多条记录，应先根据注释提取目标CDS。负链基因需要使用已经按编码方向整理的序列，带内含子的基因则要使用正确拼接后的编码序列。

　　①通过【File】→【Open】打开目标序列文件，在文本窗口中选中要分析的碱基序列。

　　②选择【Sequence】→【Load Sequence】→【From Selection】，将选中的序列载入当前通道。

　　③在【Channel】面板核对当前序列和长度。切换过通道时，重新选中目标序列，再进行后续设置。

　　2、确认分析范围与遗传密码表

　　①在【Sequence】菜单下找到当前序列或当前通道子菜单，打开【Analysis Definition】。

　　②在【Analysis Region】中设定统计区间。如果当前通道仅包含目标CDS，点击【All】选用整条序列，再用【Show Ends】核对首尾碱基。

　　③通过【Protein】→【Select Genetic Code Table】选择与序列注释一致的遗传密码表，再返回当前通道。

　　序列注释里若标有transl_table，可以用它核对密码表。以脊椎动物线粒体为例，标准密码表中的终止密码子UGA在线粒体密码表中编码色氨酸。即使三联体的计数相同，选用不同密码表也会改变它归入哪个氨基酸组，进而影响对同义密码子占比的解读。

　　3、按阅读框生成统计表

　　①依次选择【Protein】→【Codon Usage】，按目标序列的起读位置选用【Reading Frame 1】、【Reading Frame 2】或【Reading Frame 3】。如果已载入从完整密码子的首个碱基开始、方向正确的CDS，选用【Reading Frame 1】。

　　②打开生成的图形窗口，核对表头中的序列名称、翻译区间和阅读框编号，并记下表中列出的密码子总数。

　　二、DNAMAN密码子使用频率怎么看

　　报告中每种密码子对应一个格子，格子里依次给出氨基酸、计数、每千频率和同义组内占比。读表时可以先找出目标密码子的格子，再根据比较目的选用对应的数字。

　　1、用计数和每千频率看全序列分布

　　表中可能用RNA字母表示密码子。例如，标准遗传密码下，DNA中的GTG对应表里的GUG，编码缬氨酸。

　　①在【Codon Usage】结果表中，按左侧、顶部和右侧分别对应的第一、第二和第三位碱基定位【GUG】。

　　②读取该格中的【Number】。如果显示12，表示GUG在本次统计范围内出现了12次。

　　③读取【Frequency(in 1000)】。假设报告中的密码子总数为300，用12除以300，再乘以1000，结果为40，也就是每千个密码子中折算为40个，占全序列统计总数的4%。

　　2、用同义组占比比较密码子选择

　　①在【Codon Usage】表中找出编码缬氨酸的【GUU】【GUC】【GUA】【GUG】，分别记录【Number】。

　　②将这四种密码子的计数相加，再用GUG的计数除以该组总数，换算成百分比，与表中的【Preference(in 100)】核对。

　　如果缬氨酸对应的密码子共有20个，其中GUG出现12次，GUG的组内占比就是60%。这个60%的分母只有缬氨酸对应的20个密码子。前面算出的4%则以报告中的300个密码子为分母。比较同一种氨基酸用了哪些密码子时，组内占比更贴近问题，同时保留计数也方便判断这个比例来自多少个观测。

　　三、DNAMAN密码子统计结果如何核对和比较

　　一张表反映的是当前统计区间。遇到密码子总数异常、翻译结果提前终止，或者两条序列的频率差得很大时，可以先核对输入，再解释差异。

　　1、检查区间、方向和起读位置

　　①回到【Analysis Definition】，用【Show Ends】核对首尾序列，将【Analysis Region】与原始CDS注释对照。

　　②对照报告表头的阅读框编号，确认【Reading Frame】的选择与编码起点一致。若发现当前通道装入的是负链CDS所在区段的正链序列，重新载入按编码方向提取的CDS。

　　③使用与注释一致的【Select Genetic Code Table】设置检查翻译结果。若完整CDS内出现意外的提前终止，核对序列方向、拼接边界和起读位置后，再运行【Codon Usage】。

　　CDS长度能被3整除，可以作为完整序列的一项检查。即使长度符合要求，仍可能选错链或起点。末端终止密码子是否包含在分析区间，也应一并记下，方便日后按同一口径重算。

　　2、保存统计结果并按同一口径比较

　　①分别对要比较的序列运行【Codon Usage】，记录各自的序列名称、分析区间、阅读框、遗传密码表和报告总数。

　　②需要保存密码子使用表时，通过【Protein】→【Save/Append Codon Usage File】输入新文件名。要保留每条序列各自的结果，就为它们分别命名。

　　③对照不同报告中的【Frequency(in 1000)】比较全序列频率。比较同一种氨基酸的密码子选择时，同时记录【Preference(in 100)】和该氨基酸对应的计数合计。

　　两条序列长度不同，直接比较次数容易受到总量影响。组内计数很少时，比例也容易波动。比如某种氨基酸只出现两次，改用一个同义密码子，组内比例就可能相差50个百分点。这样的结果可以描述这条序列的用法，推断宿主整体偏好还需要范围更广的参考数据。

　　总结

　　DNAMAN的密码子使用表既能描述某种三联体在整段编码序列里有多常见，也能显示它在同义密码子中占多少。做单条序列分析时，把频率和原始次数一起保留，能看出一个偏高的比例是否只来自少数几个位点。需要长期比较多条序列时，连同编码区边界、阅读框和密码表一起归档，后续换样本或重新统计时才有可核对的口径。