测序片段与参考序列比对后出现空位，换一种方法，一致性百分比也变了。这不一定代表测序有误，分析区段、序列方向和打分参数都会影响结果。关于“DNAMAN怎么进行序列比对DNAMAN序列比对结果不一致怎么办”，这里以Windows英文界面中的DNA序列比对为例介绍。

　　一、DNAMAN怎么进行序列比对

　　两条序列适合逐项查看差异，多条同源序列则可以用多序列比对观察保守区域。操作前要确定比较对象，避免把不同基因片段混在一起。

　　1、打开文件并核对分析范围

　　FASTA文件可以包含多条序列，文件数量与序列数量并不总相同。名称、长度和分析范围都应核对。

　　①点击【File】→【Open】，打开待比较的FASTA或GenBank文件，检查载入的序列名称。

　　②点击【Define Sequence】，确认【DNA】类型，检查分析范围是否覆盖需要比较的区段。

　　③保留原始文件，把截取区段另存为分析副本，记录参考序列版本及截取位置。

　　2、进行两条序列的比对

　　①将两条序列载入通道，点击【Pairwise Alignment】，选择【DNA】及对应的参考序列、待测序列。

　　②比较两条序列的完整对应关系时，在【Alignment Method】中选择【Needleman&Wunsch(global)】，核对缺口罚分。

　　③点击【OK】运行，在结果窗口查看【Identity】、空位及差异位置。

　　全局比对关注两条序列从头到尾的对应关系，局部比对寻找相似区段。短片段与全长参考序列比较时，两种方法覆盖的范围可能不同，得到的百分比不能直接混用。

　　3、进行多条序列的比对

　　①点击【Multiple Alignment】工具，在序列选择页点击【File】，加入待比较文件，核对序列总数并选择【DNA】。

　　②进入方法页，选择【Full Alignment】，对当前输入序列重新进行完整比对。

　　③在参数页点击【Default Parameters】，检查【Gap Open】和【Extension】，记录实际使用的值。

　　④点击向导末页的【Finish】或【OK】运行，检查序列排列、两端空位及保守区段。

　　Full Alignment会重新计算已有排列。若任务是保留既有比对并加入新序列，应根据输入情况选择对应的Profile方法，不能沿用完整重比对后还期待原排列完全不变。

　　二、DNAMAN序列比对结果不一致怎么办

　　对照结果时，先确认输入相同，再比较方法与参数。只看截图或百分比，很难定位差异。

　　1、检查区段和序列方向

　　测序片段可能来自相反方向，参考序列也可能一个是完整基因、另一个只保留编码区。这些差别会直接改变排列。

　　①分别打开原文件，在【Define Sequence】中核对长度、分析起止位置和序列类型。

　　②方向不明确时，在双序列比对中勾选【Best alignment of dsDNA】；多序列比对中检查【Try both strands】。

　　③比对完成后记录所用链方向，将两份结果对应到同一参考区段，检查含【N】的模糊位置。

　　2、统一算法和缺口参数

　　①在【Multiple Alignment】的方法页核对【Full Alignment】与【Fast Alignment】，比较重复结果时使用同一种方法。

　　②在相应参数页核对【Gap Open】和【Extension】，区分双序列预比对与多序列比对阶段的设置。

　　③另存一组结果，每次只改变一类参数，重新运行并比较差异区段。

　　开启缺口和延长已有缺口是两种不同的代价，改变罚分可能使空位重新分布。重复序列附近尤其可能出现不同排列，不能为了得到更高一致性而随意降低罚分。

　　3、分清统计差异和显示差异

　　颜色变了，未必代表碱基排列发生变化。两条序列的一致性、多序列整体统计，以及蛋白质相似残基比例，也不是同一项指标。

　　①核对结果中的【Identity】对应哪些序列，记录实际比较区段和缺口情况。

　　②在多序列比对编辑器点击【Options】，检查【Shading Homology】和【Show consensus sequence】相关设置。

　　③对照原始字符和位置编号，检查差异是否仅来自着色、换行或序列显示顺序。

　　④与BLAST结果比较时，同时核对局部匹配范围和覆盖长度，不仅对照百分比。

　　三、DNAMAN比对结果怎么保存和复核

　　比对图方便阅读，可继续分析的序列文件同样要保留。后续发现疑问时，有原始输入和参数记录，才便于重新核对。

　　1、分别保存数据和展示结果

　　①在多序列比对编辑器点击【File】→【Save】，保存当前比对。

　　②点击【Output】→【Sequence File】，选择【CLUSTAL】或【FASTA】格式，输出到文本窗口后保存，检查对齐空位。

　　③将原始输入、比对文件和参数记录放入同一任务文件夹，区分自动生成版与人工调整版。

　　图片不能替代序列数据。插入空位或截短序列后，比对列号可能与原始序列坐标不同，报告差异位置时仍需回到参考序列核对。

　　2、复查影响结论的差异位点

　　①根据比对中的差异位置回查【原始序列】，有测序峰图时核对相应信号。

　　②使用同一组输入和参数重新运行【Pairwise Alignment】或【Multiple Alignment】，记录仍存在疑问的位置。

　　总结

　　DNAMAN的序列比对功能，让测序片段、参考序列和同源序列之间的差异更便于查看，也为后续分析提供了依据。不过，比对结果仍需要结合数据质量和研究目的来判断，百分比高低不能代替对具体位点的核实。对于“DNAMAN怎么进行序列比对DNAMAN序列比对结果不一致怎么办”，掌握操作之外，也要逐渐熟悉不同方法的适用范围。遇到暂时无法解释的差异，可以保留记录，待补充数据后再作判断，不必急着得到一致的答案。希望大家能在使用中积累经验，让比对结果更好地服务于自己的分析工作。