做质粒构建、PCR片段验证或者双酶切鉴定的时候，如果能提前在DNAMAN里做一下酶切模拟，就可以少走一些弯路，避免选错酶或者把片段大小判断错了。不过酶切模拟的关键并不仅仅是看看有没有切点那么简单，还得注意酶切位点的数量、切割的位置、切出来的片段有多长，以及这些片段适不适合接着做下一步的连接。尤其是质粒这种环状序列和PCR产物这类线性片段，它们计算片段长度的方式是不太一样的，所以在开始分析之前，先要搞清楚自己要处理的究竟是环状还是线性的序列。
一、在DNAMAN里怎么做酶切模拟
在动手做酶切模拟之前，首先得把目标DNA序列文件给打开，这段序列既可以是整个质粒的全长，也可以是某条PCR产物或者某个目标基因的片段。导入以后别急着马上分析，最好先检查一下序列的方向、长度还有碱基是不是都正确，千万别拿一段缺头少尾的序列就去跑酶切，要不结果肯定不可靠。
1、找到限制性酶分析功能
打开序列之后，下一步是找到限制性内切酶分析功能的入口；根据DNAMAN版本的不同，这个功能可能藏在【Sequence】、【Analyze】或者【Restriction Analysis】这些菜单下面，虽然名字会有些区别，但基本操作套路都是一样的：先选一个酶库，再设好筛选的条件，最后让软件在当前序列上从头到尾扫一遍。
2、把需要用的酶挑出来
在列出来的酶库列表里，把自己打算用的限制性内切酶一个一个地勾选上，像实验室里常用的EcoRI、BamHI、HindIII、XhoI这些都可以直接找到。如果只想看最常用的那几种酶，就选常用酶库，或者自己手动点选；假如需要做一次比较全面的筛查，那就把更多的酶都加载进来。如果是设计双酶切实验，那两个酶要同时勾上，并且还得分别看看它们在这条序列上到底各自有几个切点，这个信息后面判断结果的时候非常关键。
3、把序列类型设置好
接下来要告诉软件，现在分析的这个DNA到底是环状的还是线性的；像质粒一般都按环状DNA来理解，而PCR产物就是典型的线性DNA。一个环状的质粒如果只被某一种酶切了一次，它就会从闭合的环变成一条线性的全长片段；可要是一条线性DNA被切一次，就会直接断开成两段。这两种情况算出来的片段数量完全不同，所以这个类型设置一旦搞错，后面的片段长度判断就全都跟着错了。
4、开始跑酶切分析
上面的选项都设置好以后，点一下分析或者确认键，DNAMAN就会在序列图谱或者在结果列表里把每一个酶切位点给标注出来；这时可以去查看每种酶的识别序列是什么、它切在序列的哪个位置，还有一共出现了几次。如果一个酶在序列上出现了好几个切点，那再用它去做克隆验证就得多加小心了，因为它可能会把片段切得太碎，最后拿不到想要的结果。
二、酶切之后片段长度该怎样看
酶切完成以后，片段的长度一般都会直接显示在结果表格里，或者在图谱的注释和片段列表当中。看结果的时候，一定不要光盯着酶的名字有没有出现，重点要去看切点位置和片段大小（fragment size）这两项。
1、读懂酶切结果列表
分析跑完之后打开结果窗口，里面会把每个酶的切点位置都清楚地列出来。比方说一个5000 bp的质粒，如果某个酶只切了一次，那结果列表里通常就会显示出一条5000 bp的线性片段；但如果用了两个酶，一个切在1000的位置，另一个切在3000的位置，那么就会产生大概2000 bp和3000 bp的两段产物，片段的大小就是这么根据切点之间的间隔算出来的。
2、对照图谱上的片段标记
除了看表格，还可以直接在质粒的环状图谱或者线性图上观察酶切标记；两个相邻切点之间的那段距离，就代表了它们中间这一片段的长度。不过对于环状质粒要额外注意一点，那就是从最后一个切点绕回到第一个切点中间圈住的那一段距离，其实也对应着一个片段，千万别把它给漏算了，否则会少掉一段关键的产物。
3、分清单酶切和双酶切的用途
单酶切主要是用来检查质粒能不能被顺利地线性化，也就是看它能不能从环状被切开变成一条单一长度的线状DNA；而双酶切更适合用来验证插入片段的方向和大小是不是都对了。做完双酶切以后，得到的目标片段长度应该跟你预期插入的片段或者载体骨架的长度吻合，要是结果里多出了一些意料之外的小片段，就得回过头去仔细查一查有没有隐藏的额外切点。
三、怎样去核对酶切的模拟结果
酶切模拟虽然跑完了，但还不能完全照着它直接上手做实验，还需要结合实际的实验条件再确认一下；毕竟软件上能切开，不代表在试管里就一定能顺顺利利地成功。
1、查清楚酶切位点是不是唯一的
如果是准备把质粒线性化，那最好是选一个在整个质粒上只有一个切点的酶，这样得到的线性产物才单一；如果想要把插入在质粒里的目的片段释放出来，那两个酶就应该刚好分别位于插入片段的两端，而且载体的其他位置不能再出现这两个酶的切点，否则会切出多余的片段，影响回收。
2、看看片段长度能不能跑胶分开
这一点很关键，因为最后要靠琼脂糖凝胶电泳来区分各个片段，如果两个片段的长度靠得太近，比如一个是3000 bp，另一个是3200 bp，跑胶的时候这两条带很可能分不开，混在一起就不好判断了；遇到这种情况，最好换一种酶，或者重新设计一套验证方案。
3、注意甲基化和缓冲体系的兼容性
有些限制酶对甲基化比较敏感，如果序列上存在甲基化修饰，酶就可能切不动；另外双酶切的时候，这两种酶能不能在同一份缓冲液里都保持很好的活性，也需要提前查清楚。DNAMAN主要是帮我们在理论上判断切点和片段长度，正式做实验之前，还是得翻开酶厂家的说明书，把反应温度、缓冲液类型和酶切时间这些细节都确认过。
4、把模拟结果保存下来
方案敲定以后，最好把酶切图谱或者结果列表存一份，上面记录好选用了哪些酶、切点各在哪里、每个片段有多长，以及预期的电泳条带大概是怎样的分布。这样一旦后面实验跑出来的条带跟预想的不太一样，就能立刻拿这份理论结果出来做对照，很快看出问题到底出在哪个环节。
总结
总结来说，在DNAMAN里做酶切模拟和分析片段长度，操作的大致顺序就是：先把DNA序列打开，接着进入限制性酶分析功能，挑好要用的酶并且确认好序列是环状的还是线性的；结果出来以后，重点去看切点的位置、切点的个数还有各个片段的长度。单酶切主要用来验证能不能顺利线性化，双酶切则要检查目的片段和载体骨架的大小是否符合预期；最后，还要把电泳的分辨率、实际的酶切条件以及甲基化这些因素结合起来，再去动手做实验确认结果。
