做PCR实验的时候，如果胶图上出现了很多杂带，目标条带特别弱，连阴性对照都出现了不该有的条带，就不能只盯着引物的Tm值和GC含量去看了。DNAMAN这款软件可以用来做引物的特异性分析，以及筛掉那些可能出现在非目标位置的结合位点。分析的关键，是把设计好的引物重新放回目标序列和相关的背景序列里面去做比对，然后去查看引物的3'端匹配情况、错配出现在什么位置，还有可能会扩增出哪些片段。DNAMAN本身提供了PCR引物设计、多序列比对和序列分析这些功能，比较适合先在本地电脑上对目标模板做一轮初步的筛选。

　　一、DNAMAN怎么做引物特异性分析

　　在开始分析引物特异性之前，需要先把目标序列、正向引物和反向引物都准备好。如果样本里可能含有同源基因、载体上的序列或者近缘物种的序列，这些背景序列也应该一起导入进来，方便后面做比对。

　　1、导入目标序列

　　打开DNAMAN，把FASTA格式、GenBank格式或者手动复制的目标DNA序列导入进去，接着要确认序列的书写方向、总长度，以及准备扩增的那段区域到底在什么位置。一旦模板序列的版本弄错了，后面的特异性判断也会跟着跑偏，这一步很关键。

　　2、录入引物序列

　　找到软件里跟引物设计或者Primer有关的功能模块，把正向引物和反向引物分别填进对应的位置里。填好之后，先查看一下这几项基本参数：引物的长度、GC含量、Tm值，还有是不是容易形成二聚体或者发卡结构。对于常规的PCR引物，长度一般可以参考18到24个碱基的范围，GC含量大概在45%到55%之间，Tm值也要控制在合适的区间里，这些都可以在软件界面上直接看到。

　　3、检查引物在目标序列上的结合位置

　　把引物序列和目标序列拿来做一次匹配，确认正向引物和反向引物是不是都只结合在预期的区域里，并且方向也是正确的。特别是反向引物，要注意它应该是按照反向互补的关系去识别的，避免把原先的序列方向填错而导致结合位置完全不对。

　　4、用多序列比对来做辅助判断

　　如果目标基因有好几个同源拷贝，或者跟近缘物种的序列很相似，就可以把这些相关序列全部选进来做多序列比对。比对完之后，重点观察引物尤其是3'端落在什么位置，是不是处在序列差异较大的区域。DNAMAN既能比对DNA也能比对蛋白序列，而且允许只选目标序列中的一段区域来做局部比对，对比对灵敏度也可以进行控制，用起来比较灵活。

　　二、DNAMAN非特异性结合位点怎么筛掉

　　对于可能存在的非目标位置的结合，不能只盯着总的错配数量就下结论，错配出现在引物3'端的具体位置，往往比错配总数更加重要。一个离3'端比较远的错配，有时候挡不住扩增反应，而3'端一旦连续匹配得太好，非目标的片段就更容易被扩增出来。

　　1、优先把3'端高度匹配的非特异位点排除掉

　　分析的时候，要专门去看引物3'末端的最后五个到八个碱基，检查它们是不是跟非目标区域存在连续匹配的情况。要是某个非目标位置在这关键的3'端匹配得非常牢固，哪怕上游中间有一两个碱基错配了，使用这对引物时也得小心一些，因为DNA聚合酶很可能还是会从这个地方开始延伸，产生杂带。

　　2、留心那种能形成合理扩增产物的引物组合

　　有时候单条引物在非目标位置有一个很弱的结合点，这未必会导致问题；更需要关注的，是正向和反向这两条引物有没有同时结合在同一个模板上，而且方向是相对的、之间的距离也在普通PCR能够扩增出来的范围内。如果发现正反向引物在非目标区域能夹出一个长度合适的片段，那就说明存在产生非特异产物的实际风险，通常需要把其中一条引物重新设计一下。

　　3、通过微调引物的位置来避开非特异区域

　　如果非特异结合位点比较多，可以先在目标区域的两侧，尝试把引物的起点或者终点左右挪动几个碱基，尽量让3'端落在目标序列独有的碱基上，而不是落在跟其他序列相同的保守碱基上。但是也不要单纯为了降低非特异性就把引物拉得很长，否则Tm值和二级结构很可能又会变差，带出新的麻烦。

　　4、拿到本地的分析结果后，再用更大的数据库复核一遍

　　DNAMAN比较适合做本地模板的初筛，但如果样本情况比较复杂，最好还是接着把引物序列拿到Primer-BLAST这类在线工具里，在NCBI的大数据库里再查一遍特异性。在NCBI的说明里也提到，可以输入一对引物，再选定一个物种范围和数据库，用来专门检查在所选范围内的模板和特异性情况，这样得出的结论会更全面。

　　三、DNAMAN引物筛选后还要检查什么

　　就算已经筛掉了那些看起来很不靠谱的非特异位点，也还不能马上拿去合成，接下来还得看看这对引物本身是不是真的适合拿来做扩增实验，因为特异性再好，扩增效率很差的话，PCR的结果照样不会理想。

　　1、检查引物自身的二级结构

　　利用软件的分析功能，查看这对引物是不是容易形成发卡结构、自二聚体，还有正反两条引物之间会不会相互配对，也就是互补二聚体。要特别留意的是，如果两条引物的3'端恰好互补，那就很容易在反应体系里形成引物二聚体，这种二聚体一旦大量出现，就会消耗掉引物和原料，让真正想要的目标条带变得很弱，甚至完全看不见。

　　2、看一下正向和反向引物的Tm值差距

　　两条引物的Tm值最好不要差得太远，差距比较明显的时候，在同一个退火温度下面，很难同时兼顾两条引物的结合效率。如果退火温度调得偏向其中一条，另一条就可能因为结合不够充分而影响扩增；反过来，如果为了将就Tm值低的那条而把温度往下调，Tm值高的那条又容易跑到别的地方去发生非特异性结合，所以Tm值的一致性也是需要留意的一个指标。

　　3、用梯度PCR实验来实际验证

　　软件筛选和理论计算只能帮着把风险尽量降低，但它没有办法完全替代真实的实验室验证。在正式开始大批量处理样本之前，最好先在PCR仪上设置一个退火温度梯度，跑完电泳以后，根据胶图上目标条带的清晰程度，还有背景杂带的多少，来判断在哪个温度区间里表现最理想，然后再把这组条件定为最终的实验条件，这样才比较稳妥。

　　总结

　　用DNAMAN来分析引物的特异性，大体的操作顺序是先把目标序列和引物都导入进软件，检查结合位置、Tm值、GC含量还有二级结构这几项基本指标，接着通过序列比对去查看同源区域当中可能存在哪些结合位点。在筛除非特异性结合位点的时候，要重点查看引物3'端的连续匹配情况、正反向引物之间的距离和方向，还有可能生成的扩增产物。如果面对的样本比较复杂，最好把本地分析的结论用Primer-BLAST这类外部数据库再复核一次，最后通过梯度PCR实验来确认真实的效果，这样就能让PCR的结果更加稳定可靠。